补肾调周法对PCO大鼠高雄激素血症影响的实验研究

多囊卵巢综合征(Polycystic  ovary  syndrome，PCOS)是一种发病多因性、临床表现呈多态性的内分泌综合征，也是生育期妇女月经紊乱最常见的原因，以长期无排卵和雄激素过多为基本临床特征^[1]。其发病率占育龄妇女的5%～10%^[2]。高雄激素血症是PCOS发生发展的最重要的内分泌特征。卵巢局部和循环雄激素水平升高，造成无排卵及月经稀发，闭经，多毛，痤疮，肥胖，黑棘皮症等临床表现。故临床应针对高雄激素血症进行治疗。本实验通过观察补肾Ⅰ号方、补肾Ⅱ号方单独应用与补肾调周（补肾Ⅰ号方+补肾Ⅱ号方）应用对 PCO大鼠血清睾酮（T）、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、LH /FSH比值和卵巢形态学改变的影响，探讨补肾法对 PCOS雄激素改善的作用机理。

1  实验材料　

1.1  药物与试剂  ①煎剂1（补肾Ⅰ号方方）：当归15 g，川芎10 g，白芍15 g，熟地15 g，淫羊藿30 g，紫石英30 g，黄精30 g，女贞子30 g，香附10 g，甘草6 g。上方共 191g，加水浓煎 。每毫升含生药 3.7g。②煎剂2（补肾Ⅱ号方方）：菟丝子 30g，续断30g，桑寄生15g，何首乌15g，炒杜仲10g，山药15g，黄精30g，淫羊藿30g，木香6g，甘草3g。上方共 184g，加水浓煎。每毫升含生药4.17g。将煎剂1和煎剂2装入有色瓶中，储于0–4℃冷箱备用。以上药物购于河南中医学院三附院中药房，由河南中医学院药理实验室制备，批号：20070806。T、LH、FSH放射免疫分析测定盒：深圳拉尔文生物工程技术有限公司，批号均为20071101。左炔诺孕酮硅胶棒：上海达华药业有限公司生产，批号：20060101。注射用绒促性素粉针剂：丽珠集团丽珠制药厂生产，批号： 070603B。

1.2  实验动物  SD(Sorafre—Dawlee)雌性大鼠，24日龄,体重50±5g 。由河南省实验动物中心提供。

2  实验方法

2.1  造模方法及分组  SD雌性大鼠，50只，24日龄，体重50±5g,模型复制后随机分为5组，(1)正常对照组、(2)模型对照组 、(3)补肾Ⅰ号组 、(4)补肾Ⅱ号组、(5)补肾调周组，每组10只，分笼喂养。模型复制依据文献^[3]：除正常对照组外，在大鼠24日龄皮下埋植左炔诺酮硅胶棒(用25％乌拉坦麻醉大鼠，6mL·kg^—1，剪去腹毛，安尔碘消毒皮肤，取下腹部切口0．5cm，用皮埋套管针埋人3mm硅胶棒，缝合切口，消毒伤口，正常饲养)，在大鼠27日龄时颈背部皮下注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)1.5IU／只，每天 2次，共注射 9天至35日龄。正常对照组每天注射同容积生理盐水，共 9天。大鼠 35日龄时称体重。36日龄时连续阴道上皮细胞涂片两个性周期(每个性周期4天)。阴道角化细胞持续出现，提示 PCOS 大鼠模型制作成功。

2.2  给药方法  从大鼠44日龄开始(既模型复制成功后) ，3-5组大鼠分别灌服补肾Ⅰ号47.75g/kg/d；补肾Ⅱ号46g/kg/d;，补肾调周组 序贯灌服补肾Ⅰ号和补肾Ⅱ号（第1-2天补肾Ⅰ号,第3-4天补肾Ⅱ号，依此类推给药），剂量同前，连续 12天。1-2组每天灌服生理盐水。各组动物等容给药(20mL/kg)。

2.3  取材及指标测定  动物连续给药12天，禁食24小时后将各组大鼠称重，断头采血5—8mL，离心，2000r／min，10min，取血清，置–4℃冰箱保存。解剖同一侧卵巢，去除表面脂肪组织，经固定、切片、HE 染色，光镜下观察卵巢形态学的改变。采用放射免疫法测定T、LH、FSH的含量。具体操作严格按照其放射免疫分析药盒说明书进行。

2.4  统计学方法  数据采用计算机SPSS（13.0）统计分析软件处理，计量资料所有数据以均数（ ）±标准差（ｓ）表示，先确定样本是否符合正态分布，再行方差齐性检验，用单因素方差分析进行多重组间差异性比较。P<0.05差异有意义，P<0.01有显著性意义。　

3  结果　

3.1  血清T、LH、 FSH测定：见表1。结果表明，与空白对照组相比,模型对照组T、LH明显升高（P<0.01），FSH明显降低 (P<0.01),说明造模成功；与模型对照组相比，补肾调周组血清T显著降低 (P<0.01)，补肾Ⅰ号方 、补肾Ⅱ号方有降低血清T的作用（P<0.05），但其与补肾调周组相比较，差异具有显著性（P<0.05）；与模型对照组相比，补肾调周组血清LH显著降低(P<0.01)，补肾Ⅰ号方组 、补肾Ⅱ号方组血清LH与模型组比较，差异没有显著意义（P>0.05）；补肾调周组血清FSH显著高于模型对照组(P<0.01)，补肾Ⅰ号方组 、补肾Ⅱ号方组有升高血清FSH的作用（P<0.05），但其与补肾调周组相比较，差异具有显著性（P<0.05）。

表1  各组大鼠血清T、LH水平的比较( ±ｓ)　

注:与模型对照组比较(*P<0.05，**P<0.01)，与空白对照组比较 (^∆P<0.05)

3.2  卵巢形态学的观察：空白对照组光镜下可见各级卵泡发育良好，数量较多，卵泡内各层结构清晰，颗粒细胞层形态完整，排列整齐；黄体细胞排列呈脑回状，细胞大而圆。模型对照组大鼠卵巢皮质内各级发育期卵泡少见，多数呈囊性扩张，扩张的卵泡壁颗粒层细胞层明显减少，或仅剩1～2 层，或消失，排列疏松，腔内无卵丘及卵细胞，间质细胞增生，黄体组织罕见。补肾Ⅰ号方、Ⅱ号方组多数卵巢皮质可见各级卵泡，皮质内可见闭锁卵泡及大量闭锁卵泡形成的间质腺，有少量黄体形成。补肾调周组多数卵巢可见发育期各级卵泡，颗粒细胞层较模型对照组明显增厚，形态完整，排列整齐，可见卵丘及卵细胞，黄体组织数量显著增多。

4  讨论　

多囊卵巢综合征发病机理复杂，如患者长时间单独服用某一西药或多种西药往往会产生一些副反应。而中药治疗往往具有多靶点、多环节、多途径效应，可以针对PCOS患者体内紊乱的内分泌与代谢起到同时调节作用，特别对于高水平雄激素有良好的改善作用，且服用相对安全^[6]。因而探索中医药治疗本病具有深刻意义。补肾调周法是结合中医对月经产生机理的认识，祖国医学的脏腑、气血、冲任和阴阳学说等理论及现代医学月经周期中卵巢功能变化的规律制定的中药人工周期疗法。选方组药谨守女性月经周期的生理特点和PCOS以雄激素升高为主要病理改变的机制。其中补肾Ⅰ号方以熟地、黄精滋肾益精，填补真阴为君，现代药理研究表明补肾阴药如熟地、黄精等配合使用能明显降低血液中雄激素，使排卵率增加^[7–8]。当归、女贞子滋阴养肝, 补血和血，淫羊藿、紫石英偏于补阳，在此取“阳中求阴”之义，且紫石英有兴奋卵巢的功能，共为臣药。白芍功于养血柔肝，香附长于疏肝理气，川芎活血行气，使补血而不滞血，均为佐药。使以甘草，调和药性。诸药合用，共奏滋阴补肾，填精益髓之效。研究表明芍甘相伍可直接作用于卵巢，使卵巢的类固醇代谢正常化，从而抑制卵巢分泌睾酮，另外芍甘相配可能与糖皮质激素作用相同，抑制肾上腺性雄激素产生，但不影响脑垂体释放黄体生成素和卵泡刺激素^[9]。补肾Ⅱ号方以菟丝子补阳益阴为君。桑寄生、续断、炒杜仲、淫羊藿长于温补肝肾、壮阳益精，山药、黄精功于滋阴益肾，养肝补脾，填精补髓，取“阴中求阳”之义，共为臣药。何首乌功于补肝肾、益精血，木香乃三焦气分之药，升降诸气而为佐。甘草有植物雌激素作用，调和诸药而为使。诸药相伍，肝脾肾阴阳兼顾，仍以温补肾阳为主，妙在阴中求阳，以达阴平阳秘之效。研究证明，菟丝子、续断 、桑寄生等补肾阳药能使血液中孕激素增加，提高垂体对黄体生成素释放激素(LH—RH)的反应和卵巢对LH的反应。

本实验结果说明，补肾调周法治疗能显著降低模型大鼠血清T、LH含量和LH/FSH比值,升高血清FSH含量，使卵巢颗粒细胞层增厚，黄体组织数量增加。而单纯用补肾中药（补肾Ⅰ号方或补肾Ⅱ号方）治疗，血清T、LH、LH/FSH比值下降水平和FSH上升水平与模型对照组相比不如补肾调周组明显，卵巢功能恢复亦不如补肾调周组。提示补肾调周法对PCOS雄激素的改善有重要意义。与现代医学相比较，补肾中药如熟地、黄精等有降低血液中雄激素的作用，菟丝子水提取物能提高垂体对下丘脑促性腺激素的反应性，从而整体上调节了下丘脑—垂体—卵巢轴的功能，而不是单纯的激素替代疗法，其副作用小，可长期服用，远期效果较好。对预防PCOS的远期并发症如心血管疾病、子宫内膜癌等的发生提供了新的途径和方法。T、LH的升高和FSH的相对下降最终导致卵泡的发育闭锁和排卵障碍，从而出现无排卵。推测补肾法治疗可能通过对性腺轴、肾上腺及其性腺激素效应器等多水平、多靶位器官的调节起到改善卵巢功能状态的作用，具体机制有待进一步研究。

【参考文献】　

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　 肾阴药作用探讨．中华内分泌代谢杂志，1999；15(5)：259　

[9]小林拓郎.芍药甘草汤对高睾酮血症中雄激素的降低作用及诱发排卵效果和安全性.国外医学.中医中药分册，1989；11(6)：13