摘要：
p53基因的稳定性和特定位置性是它抑制肿瘤的重要功能。通过E3泛素化连接酶Mdm2调节其泛素化是p53最主要的调节机制。包括调控p53的表达和降解。尽管如此，我们仍不清楚细胞之中泛素化的p53能否被循环利用。在这里，我们将报告一个细胞质的泛素化特异性蛋白酶——USP10，它通过对p53进行去泛素化以及对Mdm2进行转化来调控p53的表达和降解。DNA损伤后，USP10持续表达，并且一小部分USP10进入细胞核激活p53。USP10的变异性和稳定性是通过ATM介导的在Thr42和Ser337的USP10磷酸化。最终，USP10通过在明确的已知有少数p53基因突癌变的细胞中表达下调来抑制野生型p53细胞中的肿瘤细胞的生长。这些发现揭示了USP10将作为p53的一个新的调控点为p53抑制携带野生型p53的癌细胞提供一个替代途径。
背景介绍：
p53是一个重要的抑癌基因，在超过50%的人类肿瘤中都有它的突变。它的主要功能是调控处于应激状态以及繁殖抑制状态的受损细胞的命运。p53诸多功能是作为一个转录因子调控它对应的靶基因来调控多种细胞功能的。包括细胞衰老、能量代谢、DNA修复、细胞分化、细胞周期和凋亡。
p53的激活、表达和调控重要是通过翻译后修饰进行控制的。如磷酸化、乙酰化及泛素化。Mdm2是一个在调控p53中扮演主要角色的E3泛素化连接酶。由Mdm2介导的p53泛素化诱导了p53的出核转运和降解。虽然出核转运一向被认为是p53降解所必须的，但后来有研究证明p53的降解同样可以发生在细胞核。有观点认为p53的泛素化程度取决于p53所在的位置，如单泛素化诱导p53的出核转运，多聚泛素化诱导p53在核内降解。某些E3泛素化连接酶（如COP1, Pirh2, ARF-BP1, MSL2, and Parc）同样被证明能够调控p53的稳定性及定位性。有确切的证据证明许多被泛素化的蛋白质通过去泛素化酶（DUBs）去泛素化。人类的蛋白质组中大约有90中个去泛素化酶。尽管如此p53的去泛素化调节机制仍然不清楚。泛素化特异性蛋白酶HAUSP已已被证明通过过表达导致p53稳定来参与了p53的去泛素化调节。尽管如此，据预测随着细胞中HAUSP的消耗，p53的水平不仅没有降低反而增加了，显而易见，HAUSP具有对Mdm2进行约束和去泛素化的能力。事实上，Mdm2似乎是一个比p53更好的HAUSP的结合伙伴。因此，通过HAUSP对p53进行调控显然是一个更复杂的过程。很可能，当致癌物通过ATM介导的磷酸化严重的阻止HAUSP和Mdm2/MdmX的结合时，在一般的细胞中，相对于HAUSP来说，Mdm2是使p53趋向于稳定的首选。另外，尽管HAUSP的某些功能在细胞间和线粒体中得以证实，但HAUSP主要位于细胞核。从这些研究中，我们要明确的一个相关问题就是细胞质中北泛素化的p53的结局以及这种结局的多种可能性。很有可能在细胞质中存在一个专门负责细胞质中的p53进行去泛素化的HAUSP同工酶，是这个同工酶维持了p53的稳定性以及回核转运。在这里我们明确了USP10是p53的一个去泛素化酶（DUB）。在一般的细胞中，USP10主要位于细胞质并负责调控p53的平衡稳定。DNA损伤后，USP10同样可以进入细胞核并协助激活p53。这些结果均揭示了在p53的定位和稳定的调控中的一个被遗忘的重要角色。
实验结果解读：
USP10和p53相互作用并保持p53的稳定性
最为幸运的是，我们发现泛素化特异性蛋白酶USP10和P53相互作用。正如数据1A和1B所显示的，USP10可以在HCT116 p53+/+细胞中被免疫共沉淀，在HCT116 p53-/-细胞中却不能。HAUSP像预先报到的同样可以和P53进行免疫共沉淀（图表1A）。我们用抗-USP10抗体在HCT116 p53+/+和U2OS细胞系中都可以将P53免疫共沉淀下来，但在HCT116 p53-/-细胞系中却不行（图表1C、数据未列出）。不像HAUSP，USP10并不能和Mdm2相互作用(（图表1D)。这些数据表明了在USP10和P53明显的存在着某种特殊的相互作用关系。为了明确USP10和P53之间是否有直接的相互作用关系，我们创造并纯化了USP10和P53组合体。在细胞外，纯化的His-USP10可以和GST-p53相互作用，这一点表明在USP10和P53之间存在直接的相互作用关系（图表1E）。对USP10中需要和P53结合的区域进行检测发现提供给USP10和P53相互作用的N端区域（AA1-AA100）是严格保守的（图表1F）。此外，FLAG-USP10 (1-100)本身就可以和P53相结合表明了USP10的AA1-100是USP10和P53相互结合的充分必要条件。
USP10既然是P53的一个泛素花特异性蛋白酶，它最有可能的功能就是维持P53的稳定性。USP10的过表达显著的增强了内源性P53的水平，它并没有增加P53信使RNA(mRNA)的水平（图表2A）。我们同样观察到P53的两个靶基因（p21和Bax）的(mRNA)和蛋白质的水平的增加。另外，被敲出了USP10的并绑定了（Δ1-100）区域的P53的过表达和转染了载体的细胞相比并不能改变内源性P53的水平（图标S1A available online）。与预先的结果相似的是HAUSP的过表达同样可以增强P53的表达水平（图标2A）。为了肯定USP10在调控P53水平中的角色，我们使用了USP10特异性短发夹RNA敲出了USP10，并且我们发现USP10的下调在没有影响P53 mRNA水平的基础上减少了P53蛋白的水平（图标2B）。当p21和Bax的mRNA和蛋白水平同样降低的时候，通过添加蛋白酶体抑制剂MG132，P53的水平降低可以被逆转，这表明USP10是通过蛋白酶体途径来调控P53的水平的。一个二次USP10 shRNA 的行为与此类似（图标2B）。这些结果均表明USP10最可能通过去泛素化下调P53的水平并保持它的稳定。为了证明USP10能够影响P53本身的稳定性，我们使用环乙酰亚胺（CHX）出来了控制细胞或稳定表达USP10 shRNA的细胞，并检测P53的稳定性。当使用耐- shRNA重构USP10来修复P53的稳定性时，P53的稳定性在稳定表达USP10 shRNA细胞中降低（图标2C）。这些结果确定了我们的shRNA的特异性，并且证明了USP10在细胞中使P53保持稳定。
HAUSP同样已经被证明能够使Mdm2保持稳定。因此我们研究了USP10是如何影响Mdm2的水平的。和已经报告的结果一样，HAUSP的下调降低了Mdm2的水平，这导致了P53水平的增加（图标2D）。尽管USP10的下调同样可以导致Mdm2水平的降低，我们依然认为这是在P53水平上的二次调控导致的下调。的确，在P53缺陷细胞中，当HAUSP的下调仍然降低了Mdm2的水平时， USP10的下调并没有影响到Mdm2的水平（图表2D和图表S1B和S1C）。这些结果表明USP10 和 HAUSP在维持P53的动态平衡中扮演了不同的角色。
USP10对P53进行去泛素化
极有可能USP10对P53去泛素化的功能以抵消像Mdm2这样的E3泛素化连接酶的活动。的确，正像图表2E所展现的那样，尽管Mdm2的过表达显著的诱导了P53的降解，但USP10的共表达有效的避免了P53因为Mdm2的诱导而降解。我们下一步检测了USP10是否调控了细胞里的P53的泛素化水平。在图表2F和2G中我们用到了蛋白酶体抑制剂MG132，因此我们才能够观察到P53的泛素化。正像图表2F中所展示的那样，Mdm2诱导了P53的泛素化，然而，P53的泛素化通过USP10 或HAUSP的共表达被显著的消弱了。另一方面，USP10C488A (USP10CA)，因核心区域酶突变而失去了USP10催化活性的细胞变异株，丧失了逆转通过Mdm2诱导的P53的泛素化的能力（图表2F和图表S1D）。相反，USP10的下调反而增强了P53的泛素化（图表2G）。这些结果表明USP10在细胞中消极的调控P53的泛素化。为了直接检测USP10对P53的去泛素化活动，我们应用了一个细胞外体系。和从细胞表达FLAG-p53、pCMV-Mdm2 和 HA-ub来泛素化p53一样，我们从细菌中纯化了USP10 和USP10CA。然后我们在一个细胞外体系中孵化USP10和泛素化的P53.就像图表2H中那样，纯化的但没有失活的USP10在试管里有效地使P53去泛素化了。这些结果证明了USP10在机体(细胞)内外均可以使P53去泛素化。
USP10集中于细胞浆中并抵消Mdm2的活动
前面的研究表明通过Mdm2泛素化的P53可能诱导了P53从细胞核转移到细胞浆。另外，胞浆泛素化连接酶（Parccan）泛素化了P53并在胞浆中捕获了P53。尽管如此，胞浆中的P53是否能够被去泛素化并回到细胞核的并不清楚。大多数的HAUSP是集中在细胞核的。然而USP10不论是在P53表达强烈的细胞还是在P53缺陷细胞中多达数都集中于细胞浆（图标2A和S2A）。我们同样通过细胞分选的方法确认了HAUSP和USP10的集中位置。正如图表S2B中所展示的那样，当USP10集中于细胞浆中时，HAUSP重要集中于细胞核。这一点引导我们做了一个假设：USP10是逆转了Mdn2诱导的P53的出核转运的胞浆P53去泛素化酶。为了证明这一假设，我们使用了免疫荧光检测法对P53的亚细胞定位进行了分析。在我们研究的细胞中很容易在细胞核中检测到P53。正如已经证明的那样，在转染了Mdm2的细胞中，我们观察到了P53的出核转运（图表3B）。和Mdm2一起进行的WT USP10的共表达逆转了Mdm2诱导的P53的胞浆转运。这些结果表明，USP10抵消了Mdm2的活动并诱导了P53从细胞浆中转运回细胞核。为了证明这一结果，我们做了细胞分选实验，并且发现Mdm2的表达诱导了P53的泛素化及出核转运（图表3C）。P53的出核转运通过USP10的共表达或LMP处理被逆转。因此，USP10和Mdm2之间的平衡可以决定P53所集中的位置。如果是这样的话，USP10的下调可能类似于影响了Mdm2的过表达。与我们的预测一致的是USP10本身的下调诱导了内生性P53的出核转运，而这一点亦可以通过LMB的以阻止（图表3D）。通USP10shRNA我们再次获得了一致的结果（图表3D）。此外，USP10的下调增加了胞浆中的P53的泛素化，而没有增加胞核中的(图表3E)。尽管胞浆和胞核中的P53均可以通过泛素化途径下调（图表S2C），但在USP10缺陷细胞中胞浆P53（不是胞核P53）的稳定性下降了（S2D）。综上所述，来自图表2和3的结果确立了USP10作为P53的胞浆去泛素化酶及其在调节P53在细胞中的稳态所扮演的重要角色。
USP10调节P53的功能。
USP10对于P53的稳定性以及入核转运的影响使USP10调节P53依赖细胞的细胞转录活性及细胞转化及凋亡成为可能。正像图表4A中所展示的，WT USP10的过表达增强了HCT113P53+/+细胞P21启动子的活性，而在HCT113P53-/-细胞中却不能。相反，催化反应不活跃的USP10（USP10 CA）或者被切除了P53的结合区域（Δ1-100）的USP10缺陷变异株
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